Metylacja DNA genu insulinopodobnego czynnika wzrostu 2 w komórkach trofoblastu wydłużonego zarodka bydła

Metylacja DNA jest niezbędnym znacznikiem epigenetycznym dla rozwoju zarodka i może być podatna na czynniki środowiskowe, takie jak warunki <i>in vitro</i>. Celem tego badania była weryfikacja wpływu hodowli <i>in vitro</i> do dnia (D) 14 rozwoju na wielkość zarodka i wzorzec metylacji DNA insulinopodobnego czynnika wzrostu <i>2< /i> (<i>IGF2</i>)-wdrukowany gen.

Aby to osiągnąć, wyprodukowaliśmy zarodki bydlęce całkowicie <i>in vivo</i>, całkowicie <i>in vitro</i> i <i>in vitro</i> do D7, a następnie <i>in vivo< /i> do D14. Zarodki wyprodukowane w <i>in vitro</i> były mniejsze niż te w pozostałych dwóch grupach (<i>p</i> = 0,024) ; nie zaobserwowano różnic w wielkości zarodków między płciami. Zarodki <i>in vitro</i> wykazywały wyższy poziom metylacji DNA w <i>IGF2</i> w porównaniu z zarodkami wyprodukowanymi całkowicie <i>in vivo</i> (IVV) (<i>p</i> = 0,009).

Co więcej, zarodki męskie wyprodukowane w całości <i>in vitro</i> wykazywały wyższy poziom metylacji DNA w porównaniu z tymi obserwowanymi dla zarodków męskich całkowicie IVV (<i>p</i> = 0,034). Nie zaobserwowano różnic między płciami pod względem metylacji DNA <i>IGF2</i>. Wyniki te pokazały, że okienko między D7 i D14 ma kluczowe znaczenie dla rozwoju zarodka, a zmiany warunków środowiskowych w tym okresie mogą zaburzać proces metylacji DNA w ważnych genach z imprintem rozwojowym. Badanie to dostarcza bezprecedensowych danych dla zarodków bydlęcych dotyczących wpływu warunków środowiskowych podczas rozwoju po wykluciu.

W ramach tej pracy zbadano późniejsze płodowe i łożyskowe skutki wprowadzenia koktajlu czynników wzrostu pochodzących z macicy podczas hodowli zarodków bydlęcych.

• Oocyty bydlęce pochodzące z rzeźni dojrzewały i zapładniano in vitro. W 4 dniu po zapłodnieniu zebrano ≥ 8-komórkowe zarodki, połączono je i poddano działaniu mieszanki embriokin, zwanej EFI, która zawierała rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (10 ng/ml), czynnik wzrostu fibroblastów bydlęcych-2 (10 ng/ml). ml) i ludzkim insulinopodobnym czynnikiem wzrostu 1 (50 ng/ml) lub do leczenia kontrolnego zawierającego tylko nośnik (CON). W 7. dniu poszczególne zarodki o jakości transferowej zostały przeniesione do biorców.
• Owulacja w określonym czasie została zakończona u dojrzałych, niekarmionych krów mięsnych. Krowy poddano sztucznej inseminacji (AI) lub otrzymały zarodek (ET) w 7 dniu po rui (n = 23-31 krów/leczenie w 4 powtórzeniach badań). Odsetek moruli i blastocyst stopnia 1 i 2 był wyższy (P < 0,05) dla zarodków leczonych EFI niż CON.
• Odsetek krów ciężarnych zdiagnozowanych w ultrasonografii transrektalnej nie różnił się w grupach AI i ET w 28., 42. i 56. dniu po rui. Nie stwierdzono również różnic w stosunku płodów płci męskiej do żeńskiej w 60. dniu po rui za pomocą ultrasonografii transrektalnej. W dniu 21 po rui względna liczebność trzech transkryptów genów stymulowanych interferonem (ISG) w leukocytach obwodowych nie różniła się w zależności od grupy AI/ET lub płci płodu.
• Stężenia krążącej glikoproteiny związanej z ciążą (PAG) różniły się (P < 0,05) w poszczególnych dniach. Wykryto również różnicę w stężeniach PAG (P < 0,05) między ciążami męskimi i żeńskimi w grupie CON-ET, ale nie w grupie AI lub EFI-ET.
• Na długość korony-zadu nie miała wpływu grupa AI/ET w dniu 42, ale była ona mniejsza (P < 0,05) w grupach CON i EFI-ET niż w grupie AI w dniu 56. Te wyniki sugerują, że suplementacja EFI jest środkiem do poprawy przenoszenia produkcja zarodków w systemie IVP bydła, ale nie jest jasne, czy to leczenie poprawia kompetencje zarodków po ET

Octan trenbolonu (TBA), analog testosteronu, zwiększa syntezę białek i zmniejsza degradację białek w hodowlach połączonych bydlęcych komórek satelitarnych (BSC). Jednak mechanizm, poprzez który TBA zmienia te procesy, pozostaje nieznany.

Ostatnie badania wskazują, że androgeny poprawiają tempo i zakres wzrostu mięśni poprzez mechanizm niegenomowy obejmujący receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), metaloproteinazy macierzy (MMP), naskórkowy czynnik wzrostu wiążący heparynę (hbEGF), receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) , erbB2 i receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 (IGF-1R). Postawiliśmy hipotezę, że TBA aktywuje GPCR, co skutkuje aktywacją MMP2/9, która uwalnia hbEGF, który aktywuje EGFR i/lub erbB2.

Aby ustalić, czy proponowany szlak niegenomowy jest zaangażowany w mediowane przez TBA zmiany w obrocie białkami, fuzje hodowli BSC poddano działaniu TBA w obecności lub przy braku inhibitorów GPCR, MMP2/9, hbEGF, EGFR, erbB2 lub IGF-1R, i wynikowa synteza białeki przeanalizowano wskaźniki degradacji. Testy powtórzono co najmniej 9 razy dla każdego eksperymentu z inhibitorem z wykorzystaniem hodowli BSC uzyskanych z co najmniej 3 różnych wołów, które nie były wcześniej eksponowane na związki steroidowe. Jak oczekiwano, fuzyjne hodowle BSC traktowane 10 n TBA wykazywały zwiększone (< 0,05) szybkości syntezy białka i zmniejszone (< 0,05) szybkości degradacji białka w porównaniu z hodowlami kontrolnymi. Traktowanie fuzyjnych hodowli BSC 10 n TBA w obecności inhibitorów GPCR, MMP2/9, hbEGF, EGFR, erbB2 lub IGF-1R hamowało (< 0,05) wzrost szybkości syntezy białek, w którym pośredniczy TBA. Alternatywnie, hamowanie GPCR, MMP2/9, hbEGF, EGFR, erbB2 lub IGF-1R w obecności 10 n TBA nie miało (>> 0,05) wpływu na spadki degradacji białek za pośrednictwem TBA.

Jednak hamowanie zarówno EGFR, jak i erbB2 w obecności 10 n TBA skutkowało zmniejszoną (< 0,05) zdolnością TBA do zmniejszania szybkości degradacji białka. Dodatkowo, fuzyjne hodowle BSC traktowane 10 n TBA wykazują zwiększone (< 0,05) poziomy białka pAKT. Dane te wskazują, że wzrost syntezy białek, w którym pośredniczy TBA, prawdopodobnie obejmuje GPCR, MMP2/9, hbEGF, EGFR, erbB2 i IGF-1R. Jednak mechanizm, poprzez który TBA pośredniczy w zmianach w degradacji białka, jest inny i wydaje się obejmować tylko EGFR i erbB2. Co więcej, wydaje się, że szlak kinazy białkowej B jest zaangażowany w wpływ TBA na fuzyjne hodowle BSC.